神经肌肉病（NMDs）
神经肌肉病(Neuromusculardisorders,NMDs)通过直接损害肌肉结构和代谢或间接影响神经元到肌肉的信号传递来影响肌肉的正常功能。大多数儿科神经肌肉病都有遗传基础，最常见的是杜氏肌营养不良症（DMD），患病率约为1:（男孩）。其他常见疾病包括脊髓性肌萎缩症、强直性肌营养不良、Charcot-Marie-Tooth病等。NMDs的诊断主要是通过肌肉活检和病理评估。近年来全外显子组测序(WES)已成为临床实践中的常规诊断方法，但其对NMDs的诊断率一直保持不变，在不同类型的NMDs的诊断率20%-76%。
年来已有多篇文献将转录组测序(RNA-seq)应用到神经肌肉病诊断，不同程度的提高了分子诊断率。如：年3月波士顿Broad研究所发表在SciTranslMed的文章"ImprovinggeneticdiagnosisinMendeliandiseasewithtranscriptomesequencing"通过RNA-seq检测神经肌肉病患者肌肉组织样本，提高了21%的诊断率（文献1）。年2医院发表在AmJHumGenet的文章"ExpandingtheBoundariesofRNASequencingasaDiagnosticToolforRareMendelianDisease"通过RNA-seq提高36%的神经肌肉病诊断率（文献2）。年3月韩国首尔大学MurimChoi团队在JMedGenet发表论文"Transcriptome-basedvariantcallingandaberrantmRNAdiscoveryenhancediagnosticefficiencyforneuromusculardiseases"利用神经肌肉病患者的肌肉活检样本进行RNA-seq，发现同时采用RNA-seq和WES的样本中，RNA-seq的诊断率更高（文献3）。
文献1概述
研究获取63例怀疑单基因神经肌肉患者的肌肉组织样本，通过RNA-seq重新诊断。有50例样本病因未明，RNA-seq诊断出17例，诊断率达到35%，为无任何候选基因样本明确诊断7（总34）例，提高诊断率21%。在4例样本中发现COL6A1基因的内含子变异，导致剪接获得事件，破坏了三螺旋结构域的关键甘氨酸重复基序。后经证实该变异为热点致病变异，在27例基因分析阴性的胶原蛋白营养不良VI型患者中检测到这种变异，解释了大约25%临床提示胶原营养不良VI型但基因检测阴性的患者的致病原因（图1）。
图1实验设计及样本概述
文献2概述
研究利用肌肉活检样本RNA-seq对25例WES或panel检测“阴性”病例，提供了36%(9/25)的遗传诊断率。通过对各组织中基因表达的比较，在肌肉组织中表达（RPKM1）的个基因，92%在T肌管细胞（成纤维细胞的转分化产生的T肌管细胞）中表达，88%在原代成纤维细胞中表达，71%在血液中表达，转分化的T肌管细胞在成纤维细胞和肌肉样本之间聚集成一个组。基于血液的RNA-seq不足以进行神经肌肉诊断，而通过皮肤培养成纤维细胞转分化产生的肌管准确地反映了肌肉转录组并揭示了致病突变（图2）。
图2样本分布与基因表达谱
文献3概述
研究募集例疑似孟德尔NMDs但没有明确分子病因的患者，获取股四头肌肌肉活检组织进行了组织病理学检查。并收集了4例健康个体的肌肉组织作为对照样本。96例血液组织进行WES检测（1例因质控不合格剔除），86例肌肉组织进行RNA-seq检测（3例因质控不合格剔除），两者重合的样本共计63例。RNA-Seq在28.9%的患者样本中获得了候选基因(24/83)，其中18个来自错义变异检测，6个来自异常剪接分析。6例异常剪接事件中，DMD基因4例，MICU1和LPIN1基因各1例。63例样本同时采用两种方法分析，RNA-Seq整体诊断率为38.1%，而WES的诊断率为34.9%（如图3）。研究人员利用改进后的软件Exomiser可检出94.7%的WES候选基因。
图3WES和RNA-seq两种分析方法诊断结果比较
文献3案例--RNA-seq检测的异常剪接事件
有三例患者有典型DMD相关表型，病理上显示肌营养不良蛋白缺失，WES未发现致病变异。RNA-Seq数据表明DMD中存在隐匿的外显子(CEs)，即新的外显子，随后的WGS发现内含子变异可能产生异常剪接并导致过早终止(图4A-C)。(A)NM_.2:c.–AG,(B)c.+CG(C)c.+GT。一名被诊断为复发性横纹肌溶解的患者LPIN1中发现了一个杂合外显子跳跃事件，由于跳跃的外显子的最后一个碱基发生了变异（NM_.4:c.GA），该变异被注释为同义变异，且SpliceAI软件预测不会导致剪接改变而没有被WES优先考虑为致病变异（图4H）。对两名患者来源的细胞(CDC_NM54.1和CDC_NM55.1;图4D-E)采用反义寡核苷酸（ASO）修复剪接缺陷，经RT-PCR证实，ASO治疗有效地诱导了CE跳跃，恢复了基因正常转录剪接，且所有测试浓度（-nM）都观察到效应(图4F-G)。
图4异常剪接事件的发现和挽救实验
文献3案例--RNA-seq检测的缺失事件
个人样本的WES由于测序reads覆盖不均一，对于基因水平一个和多个外显子的缺失检测存在着局限性。RNA-seq检测到MICU1基因多个外显子纯合缺失，WGS显示了一个包含4个外显子的约82kb纯合缺失（图5A）。在一名50多岁的女性患者中发现了包含7个外显子(~kb)的杂合缺失，该患者患有成人发病进行性肌肉无力(图5C)。未发现等位基因特异性表达或基因表达异常的显著事件。
图5RNA-seq检测的缺失事件
小结
基因的表达具有组织特异性，极大的限制了RNA-seq的应用及大范围推广。RNA-seq分析最优的材料为疾病关联的组织样本，对于神经肌肉病，肌肉活检样本为最优选择，也是较易获取的组织。用肌肉活检样本进行RNA-seq分析，可提高NMDs的诊断率。RNA-seq可作为外显子测序的有效补充诊断方法。
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