骨骼肌是人体中最丰富的组织，它有许多生理功能，从运动延伸到其他不同的重要作用，包括信号转导。肌肉损伤后，骨骼肌再生的能力依赖于驻留的肌源性干细胞，如卫星细胞。静止的卫星细胞被激活，以分裂、分化和修复受损的组织。然而，这种再生能力会受到交通事故、冲击伤、战斗伤害和手术切除后严重的急性肌肉丧失，从而导致残疾和生活质量下降。以肌肉干细胞为基础的疗法为改善骨骼肌再生提供了有希望的策略。然而，肌肉的再生潜力受到自体肌肉干细胞的缺乏和同种异体细胞免疫抑制的限制。此外，肌肉干细胞群体的体外扩增既耗时又昂贵，而且这些细胞已经降低了植入的效率。因此，细胞来源的稀缺和缺乏扩增肌源性干细胞的有效方法是使用这种方法进行骨骼肌再生的主要挑战。作为一种替代方法，皮肤真皮细胞可以通过转录因子MyoD12直接重编程细胞，或通过真皮干细胞分化，为生成骨骼肌细胞提供方便的细胞来源。然而，真皮细胞的生肌效率相对较低。小分子可以调节细胞信号，从而通过重新编程和干细胞分化来操纵细胞命运。虽然已经研究了几种小分子来维持肌肉干细胞的特性，促进成肌分化和肌肉再生，但还没有发现能选择性地从真皮细胞或肌肉基质细胞(MuSC)群体中诱导和扩增成肌干细胞用于肌肉再生的“鸡尾酒”小分子药物。
成果简介年3月19日，加州大学洛杉矶分校李松教授团队在《NatureBiomedicalEngineering》期刊发表了题为“Skeletalmuscleregenerationviathechemicalinductionandexpansionofmyogenicstemcellsinsituorinvitro”的研究论文。课题组首次发现一组可以选择性和高效地从真皮成纤维细胞样细胞和骨骼肌间充质干细胞中扩增肌源性细胞的化学小分子药物。通过预贴壁法选择原代细胞，进一步提高了成肌效率。选择性扩增的肌源性细胞可以移植到成年(8-12周)和老年(18-20个月)小鼠以及DMD的mdx小鼠模型中修复受损的胫前肌。此外，纳米颗粒传递的化学“鸡尾酒”小分子药物诱导了卫星细胞强大的原位激活和扩张，以促进成年和老年小鼠肌肉的再生。
图文解读图1.一种“鸡尾酒”小分子药物可以从真皮细胞诱导肌源性细胞。(a)真皮细胞经对照FB培养基(左)或含VCTFR“鸡尾酒”小分子药物的培养基(右)处理6?d后形成的肌管的亮场图像。(b)用不加VCTFR“鸡尾酒”小分子药物的对照培养液(左)和加入VCTFR“鸡尾酒”小分子药物的培养基(右)处理6?d的真皮细胞进行TnT染色，结果证明真皮细胞分化为肌源性细胞。定量分析从VCTFR“鸡尾酒”小分子药物(c)和F和R“鸡尾酒”小分子药物不同组合(d)中去除一种化学物质处理后第10天诱导的TnT+细胞的数量。结果表明，当F或R被省略时，TNT+细胞的数量明显减少。然后对F和R的不同组合进行筛选。仅F和R(FR鸡尾酒)的组合最大限度地提高了TNT+细胞的数量，而添加原鸡尾酒中的其他成分要么减少了TNT+细胞的数量，要么没有作用。(e)FR“鸡尾酒”小分子药物对TnT+细胞产量的量效分析，结果显示F和R的20μM组合可获得最高的TnT+细胞产率。(f)含有20?μMFR“鸡尾酒”小分子药物的基本培养基，不含或添加其它候选物诱导的TnT+细胞的数量。(g)对照基础培养基(左)或最佳FR培养基(右)诱导10?d的真皮细胞TnT染色图像。结果表明，真皮细胞体外诱导成肌的最佳培养基为：20μMF,20μMR,50μg/mLAAand50ng/mLbFGF(以下简称FR培养基)。
图2.CiMCs的表征。(a)对照培养液(上)或FR培养液(下)处理的真皮细胞在2、4、8和12天(从左至右)的亮场图像显示，化学处理后细胞形态逐渐发生变化。(b)为了进一步鉴定化学诱导的肌源性干细胞(CiMCs)，采用免疫荧光检测了不同阶段（第4天和第8天）成肌性标志物的表达，卫星细胞标记Pax7、肌祖细胞标记MyoD、分化标记MyoG和Myh3，结果显示，从第4天到第8天，Pax7+、MyoD+、MyoG+和Myh3+细胞或肌管的数量均显著增加。(c)图b细胞中阳性细胞的百分比。结果表明，这些化学物质可以诱导和扩增真皮细胞中的Pax7+卫星细胞和MyoD+祖细胞。反过来，这些细胞可能会进一步分化成成熟的肌细胞，然后融合成多核肌管。(d)RT-qPCR分析第8天CiMCs骨骼肌相关基因的表达。结果证明，与单独用F或R处理的细胞相比，FR处理的诱导细胞显示出更高的骨骼肌基因表达。
图3.CiMCs中生肌基因表达的特异性上调。(a)用RT-qPCR进一步研究了骨骼肌基因在CiMCs中的时间表达。数据显示，生肌基因-包括Pax7、mRf5、MyoD、Mymk、MyoG和Myh3在第2天都有显著上调。(b)相比之下，在实验的第12天，CiMCs的多能性基因Nanog和Oct4的表达仍然没有被检测到，这表明细胞没有经历多能性状态。(c)用流式细胞仪对第3天和第6天的细胞群体进行分析，没有发现任何SSEA1+细胞。(d)中对胚层细胞类型的其他重要标记物也进行了研究，心肌细胞(Hand2)、软骨细胞(Acan)和成骨细胞(Runx2)的标记物没有显著上调，表明骨骼肌源性细胞在FR培养基中被选择性地诱导和扩增。
图4.丰富的真皮肌源性细胞有助于化学扩张CiMCs。(a)FR培养液作用8?d后，RAC、SAC和HFC中MyH3的免疫荧光染色。(b)图a中Myh3+细胞百分比。结果表明SAC丰富的肌源性细胞促进了肌肉发生。(c)用FR培养液处理8?d的SAC中Sox10和Myh3的免疫荧光染色。白色箭头表示融合到肌管中的Sox10+细胞。(d)经FR培养液处理8?d的HFCs中Sox10、Myh3和成纤维细胞标志物FSP1的免疫荧光染色。结果表明，SAC来源的细胞中Sox10+细胞略有增加，但很少与Myh3+细胞共存。(e)在对照培养基(上)和FR培养基(下)中，第8天从SAC中诱导的CiMCs中Pax7和FSP1，Pax7和Ki67，MyoD和Ki67，Myh3的免疫荧光染色。(f)第4天和第8天SAC诱导的CiMCs中Pax7+细胞百分比(左)和基于Ki67表达的Pax7+细胞增殖百分比(右)。(g)第4天和第8天SAC诱导的CiMCs中MyoD+细胞百分率(左)和以Ki67表达为基础的MyoD+细胞增殖百分率(右)。对于f和g，对照组用不含FR的基础FB培养基培养SAC。(h)TnT和4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI；细胞核)染色显示多核肌管内有条纹。以上结果均证实了这些化学物质在肌源性干细胞扩增中的作用。
图5.真皮Pax7+亚群是扩增CiMCs的主要贡献者。(a)谱系追踪和他莫昔芬诱导的Pax7-CreER：Rosa26-eYFP小鼠的示意图。(b)用4-OHT、FR或4-OHT/FR处理12?天的Pax7谱系示踪SAC的代表性荧光图像。结果表明，4-OHT联合FR“鸡尾酒”处理CiMCs后，可在细胞内广泛检测到增强型*色荧光蛋白(eYFP)信号，而单独用4-OHT或FR处理后均未检测到eYFP的表达。(c)在第4天和第8天(从左到右)用FR培养基选择性扩增转基因小鼠的SAC。这些结果证实了4-OHT对eYFP报告基因的诱导作用和FR培养基对Pax7+细胞的扩增作用。特别是，eYFP信号在第4天开始在单个细胞中表达，之后逐渐出现在肌管/肌束中，表明化学诱导的Pax7+细胞进一步分化并融合成肌管。(d)用FR培养液培养12?d的Pax7细胞系的CiMCs进行Pax7(上)和Myh3(下)的免疫荧光染色。结果显示，几乎所有扩增的肌源性细胞和分化的肌细胞/肌管均为eYFP+。(e)在FACS分选的第4天从Pax7谱系追踪到的CiMCs的eYFP-(上)和eYFP+(下)细胞中，对Pax7和Ki67进行免疫荧光染色，在FACS分选后，将其用FR培养基进一步培养4d，从左到右依次为DAPI、EYFP、Pax7和Ki67染色，合并图像。(f)图e中Pax7+细胞百分比。(g)培养第0天(接种后6?h)和第4天，检测Pax7+eYFP+CiMCs增殖的Ki67+细胞百分率。免疫荧光分析显示，大约80%的eYFP+细胞表达Pax7并保持增殖能力，如第0天和第4天Ki67的表达所示，而在化学处理的eGFP?细胞中没有发现Pax7表达的细胞。综上所述，这些结果表明，真皮组织来源的Pax7+细胞可以通过化学诱导有选择地快速扩增。
图6.在体内植入CiMCs可促进肌肉再生。为了评价CiMCs对肌肉再生的体内治疗作用，在FR培养基中体外扩增8d后收集CiMCs，并将其注射到心脏*素(CTX)预损伤的成年、老年和mdx小鼠的TA肌中。(a)注射体外化学诱导真皮细胞来源的肌源性干细胞用于肌肉修复的示意图。(b)成年、老年和mdx小鼠移植真皮细胞(阴性对照)或CiMCs4周后，CTX损伤的TA肌的最大等长强直力。(c)4周龄对照组和CiMCs处理组小鼠TA肌的典型等长强直力曲线。结果显示，在三种模型中，CiMCs处理的TA肌肉的平均等长强直力都明显高于各自的对照组。(d)4周时取成年、老龄和mdx小鼠的TA肌，测定对照组和CIMC处理组小鼠TA肌的肌肉湿重。CiMCs治疗的TA肌肉在所有三个模型中的湿肌肉质量都明显更高。(e)将DsRed标记的对照细胞和CiMCs移植到成年、老年和mdx小鼠的TA肌内，共移植4周。(f)图e中肌肉组织中DsRed肌纤维的数量。三种模型中形成具有中心核的不同纤维大小的新生肌纤维。(g)成年、老年和mdx小鼠TA肌与对照细胞或CiMCs移植4周后，其中央有核肌纤维的平均CSA。组织学分析表明，与相应的对照组相比，CiMCs处理的TA肌肉的肌纤维的平均横截面积(CSA)增加了，特别是对于老龄和DMD小鼠的肌肉。(h)成年、老年和mdx小鼠TA肌与对照细胞或CiMCs移植4周后，典型的肌纤维(I型、IIA和IIB型)染色。(i)图h中不同肌纤维类型的百分比。与对照组相比，CiMCs治疗的所有TA肌肉中IIA型肌纤维略有减少，证实了更好的肌肉恢复。
图7.载药纳米颗粒促进肌肉再生。为了评估化学“鸡尾酒”在肌肉修复中对局部驻留的肌源性细胞的潜在作用，开发了一种受控给药系统，并将其注射到受损的TA肌肉中。(a)用于原位肌源性干细胞扩增和再生的载药颗粒的制备和注射示意图。(b)用动态光散射法测定了FR-NPs的SEM图像和粒径分布。扫描电子显微镜(SEM)分析表明，FR-NPS为均匀的球形颗粒，平均粒径为nm，多分散指数为0.24。(c)用HPLC-MS分析得到FR-NPs中F和R的累积释放曲线。结果显示，这两种化学物质在两周的时间内逐渐释放。(d)不同剂量的FR-NPs作用10?d后，SAC内Myh3+细胞百分率明显下降。为了进一步验证载药纳米颗粒对肌肉再生的体内效应，对成年和老年小鼠的TA肌肉进行了如前所述的CTX损伤，但随后注射了载体剂或FR-NPs而不是细胞，然后进行了评估。(e)环磷酰胺损伤、纳米颗粒注射及采集样品进行分析的时间点的实验示意图。(f)第14天和第28天，载体剂和FR-NPs处理肌肉的典型CMAP曲线。载体剂是指不含药物并作为对照的纳米粒子。(g)第14天和第28天，FR-NPs或单纯载体剂治疗损伤的TA肌的CMAP波幅。在第2周和第4周，FR-NPs处理的成年小鼠TA肌肉的坐骨神经复合肌肉动作电位(CMAP)波幅显著高于用载体剂处理的肌肉。(h)4周时，对照组和FR-NPs处理的成年和老龄小鼠TA肌的最大等长强直力。(i)成年小鼠4周时对照组和FR-NPs处理组小鼠TA肌的典型等长强直力曲线。与CiMCs移植的有益效果相似，在成年和老年小鼠中，FR-NPs处理的TA肌在4周时的平均等长强直力也高于对照组。肌肉重量和平均肌纤维CSA也是如此，与对照组相比，IIA型纤维的比例略低。(j)4周时取成年和老龄小鼠的TA肌，取肌肉湿重测定对照组和FR-NPs处理组小鼠TA肌的肌肉湿重。(k)成年和老龄小鼠4周时对照组和FR-NPs处理组小鼠TA肌的代表性肌纤维染色。(l)TA肌切片中央有核肌纤维的平均CSA。(m)图k中不同肌纤维类型的百分比。总之，这些结果表明药物释放纳米颗粒促进了TA肌的原位再生和修复。
图8.载药纳米颗粒通过促进卫星细胞的原位扩张来增强肌肉修复。接下来，进一步确定载药纳米颗粒是否能像FR在体外那样，特异性地原位扩增Pax7+卫星细胞并加速肌肉再生。(a)在第3天和第14天，使用载体剂(左)和FR-NPs(右)对CTX损伤肌肉中的Pax7+细胞进行免疫荧光分析。免疫荧光染色显示，与对照组相比，FR-NPs处理组肌肉中退化或再生肌纤维周围的Pax7+细胞定位更多。(b)治疗后不同时间点Pax7+细胞的定量。结果发现，在FR-NPs处理和载体剂处理的肌肉中，Pax7+卫星细胞迅速增加，并在第3天达到高峰，到第28天逐渐恢复到基础水平。然而，在第3天和第7天，FR-NPs处理的肌肉与对照组相比有更多的卫星细胞，与单独使用载体处理的肌肉相比增加了两倍以上。(c)用FR-NPS或载体剂治疗后第3天，CTX损伤肌肉中Pax7(绿色)和Ki67(红色)的免疫染色。结果显示，几乎所有的Pax7+细胞在第3天开始增殖。(d)Pax7-CreER：Rosa26-eYFP小鼠CTX损伤肌肉中Pax7+细胞的谱系追踪。图像显示，在FR-NP处理的肌肉中，在第3天，肌纤维周围有大量eYFP+细胞。这表明FR-NPs促进了损伤肌肉中现有Pax7+细胞的增殖和扩张，以促进肌肉再生。
总结本文展示了肌源性干细胞(主要是Pax7+细胞)使用特定的小分子混合物从容易获得的真皮成纤维细胞或骨骼肌干细胞中选择性地扩增，并移植到成年、老年或营养不良小鼠的肌肉损伤中，在三种动物模型中实现了功能性肌肉再生。此外，还表明“鸡尾酒”小分子药物通过聚合物纳米颗粒在原位持续释放，通过诱导常驻卫星细胞的强劲激活和扩张，导致肌肉修复。化学诱导的干细胞在体外和原位扩增可能被证明对旨在再生骨骼肌和其他组织的干细胞疗法是有利的。
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