TUhjnbcbe - 2021/8/24 21:06:00
摘要：眼咽远端肌病是一种晚发的退行性肌肉疾病，其特征是面、咽和远端肢体肌肉下垂和无力。最近的一份报告表明，LRP12的非编码三核苷酸重复扩增与该病有关。在这里，我们报告了一项中国队列的41名临床诊断为眼咽远端肌病的患者(来自7个家族的21例家系病例和20例散发病例)的遗传学研究。在一个有12个患者的家庭中,结合单体型分析和连锁分析揭示了chr19p13.11-p13.2最大的两点对数的优势(LOD)得分为3.3，其将候选区域的间隔缩小为4.5Mb。我们使用一个全面的策略结合全外显子组测序,长读长测序,通过重复引物PCR和高GC聚合酶链反应，我们在与疾病共分离的GIPC1基因的5‘UTR中发现了异常的CGG重复扩增。总体而言，51.9%的独立家系(4/7个家系和10/20个散发病例)发现了在GIPC1重复扩展，而LRP12重复扩展在我们队列中仅发现了一个散发病例(3.7%)。对照组的CGG重复次数为30次，而患病个体的CGG重复次数为60次。重复次数与发病年龄之间有轻微的相关性。在传递过程中观察到重复扩张和收缩，但躯体不稳定不明显。这些结果进一步支持非编码CGG重复扩展在眼咽部远端肌病发病机制中发挥重要作用。课题目标：在此之前，我们在GIPC1基因的5’UTR(OMIM:)中发现了异常的CGG重复扩增，在51.9%的中国起源的眼咽型肌营养不良oculopharyngealmusculardystroph(OPDM)家系(4/7个家系和10/20个散发病例)中与疾病共分离。这些结果进一步支持了非编码CGG重复扩增在发病机制中起重要作用方法学：本研究共纳入27个独立家系41例患者和30例未受影响的家庭成员，例健康对照。受影响的个体由至少两名经验丰富的肌肉学家进行彻底的神经系统检查。对于患者F1:V-10，通过靶向捕获富集了个基因，排除了已知的肌肉营养不良和其他遗传性肌病。使用ExomeDepthPackage也排除了潜在的拷贝数变异。利用dbSNP,GenomesProject,andExomeSequencingProject等公共数据库筛选已知致病变异。Family1中的三个病人(PatientsF1:IV-13,IV-25,andV-10)以及一个control(IndividualF1:III-11)采用SurePrintG3HumanCGH+SNP产前研究微阵列检测3名患者和1名来自家族1的未受影响的对照组的拷贝数变异。按照生产商的说明，用AluI(Promega)和RsaI(Promega)两种酶对基因组DNA进行酶切。使用AgilentCytoGenomics对数据进行分析。全外显子组测序(WES)进一步用于检测潜在的SNV，通过对家族1中的5例患者(患者F1:IV-3、IV-13、IV-20、V-7和VI-4)和1例对照(个体F1:V-8)进行测序。使用ILLUMINAHISEQ平台，2Xbp测序。根据已知的INDEL位点和基础组的质量评分，用GATK(V.4.0.5.1)对reads进行重新校准和重排(BQSR)。GATKHAPLOTYPECALLER用于调用rawvariants。INDELS和SNPS用ANNOVAR注释。使用ExomedepthPackage查找潜在拷贝数变异。利用公共数据库dbSNP,GenomesProject,andExomeSequencingProject进行突变筛选。采用覆盖率5X的SNP进行单倍型分析。连锁分析由MERLIN(ver.1.1.2)的参数连锁分析包进行。使用PromethION纳米孔测序仪(OxfordNanoporeTechnologies)对两名患者(患者F1:IV-25和V-10)进行长读基因组测序，使用RSII测序仪(PacBio)对另一名患者(患者F1:V-30)和一名对照(个体F1:V-28)进行长读基因组测序。使用NGMLR(v.0.2.7)将长序列与参考基因组(GRCh37)进行比对。然后使用NanoSV(v.1.2.3)进行结构变异调用，使用AnnotSV(