各种染色方法的意义
主要说明各种组织化学染色的目的是什么,每一种染色方法容易染出什么样的异常改变。
(一)HE染色
在各种染色方法中，HE染色是最重要的染色方法,从中可以得到很多信息。如果得不到正常组织图片,就说明有病理改变存在。
1、基本结构的紊乱在低倍镜下即能看到肌肉组织基本结构紊乱。包括结缔组织增生、脂肪组织增生和是否发生了炎症细胞浸润。肌束的边界不清是肌束膜和肌内膜结缔组织增生的结果(perimysialendomysialfibrosis);存在极端细小的肌束是因为该肌束的全部纤维发生萎缩(groupatrophy)。读HE片时需要检查血管、末梢神经、肌梭等部位是否存在以及出现的异常情况。
2、肌纤维的大小不同逐渐增加显微镜的倍数,继续观察肌纤维有无大小不同的情况,如果有,进一步分辨出大小不同的具体特点。肌纤维大小不同广泛存在且没有明显的规律性时,肌源性疾病的可能性大。出现小角化纤维(smallangularfiber),而且还有肌群萎缩,可以确定是神经源性变化。大小不同的直方图呈双峰性时,小直径纤维是1型还是2型,其结果大不相同。
在HE染色中进行1、2类型纤维的类型判断是有可能的。如果小直径纤维是稍微淡染的2型纤维时,多半是失用性萎缩、中枢神经疾病等非特异性改变。小直径纤维围绕在肌束周围(肌束周围萎缩,perifascicularatrophy)是多发性肌炎,特别是皮肌炎的特点,即使没有炎症细胞也可确诊。
3、核的变化最后用高倍镜观察每个细胞的变化。核的变化不算很多。正常组织切片(10um厚)中1个肌纤维有0~3个核,如果增加到5个以上属于异常,代表性疾病是强直性肌营养不良。中心核(centrallyplacednuclei)肌纤维的增加可见于肌营养不良、肌管性肌病(myotubularmyopathy)、强直性肌营养不良。
这种中心核大致向长轴方向呈链状排列(chainednuclei)。核浓染,几个核集合在一起称为固缩核聚集(pyknoticnuclearclump)。多见于神经源性肌病,也可以在强直性肌营养不良等肌源性疾病中见到。
正常肌细胞的核呈扁平型,当细胞核圆形化并浓染时,可见于神经源性疾病(非萎缩纤维也可出现)、中*、代谢性疾病、再生纤维等非常多的疾病。核仁多见于再生纤维。核略微膨大,被嗜酸性染色均匀染出时,称为包涵体,在电子显微镜下含有如同病*颗粒状的细丝,但几乎所有病*分离均失败,因此怀疑是疾病特异性改变。
4、坏死和再生在胞体变化中,最显著和重要的改变是坏死和再生。
5、肌纤维内空泡形成空泡是经常见到的胞体改变,但组织冻结过程中出现的人工伪像常出现空泡,所以鉴别是人工伪像还是其他,这一点非常重要的。人工伪像性空泡在1型纤维和2型纤维中都可出现,没有选择性,在很大的范围内数十个或数百个同时出现。组织中心部的冻结较差所以切片的中央部能看到很多空泡。
大量小空泡主要出现于1型纤维时,脂肪滴增加的可能性高,高度怀疑脂质代谢异常性肌病(lipidstoragemyopathy)。看到大小不同的明亮空泡时,糖原病的可能性大。空泡内有嗜碱性颗粒物质时考虑为糖原病Ⅱ型(糖原贮积症Ⅱ型)。大量空泡存在于胞体边缘,空泡内没有颗粒物质时应该怀疑糖原病Ⅲ型(脱分支酶缺乏症)、V型(MCA-rde病)或Ⅶ型(垂井病)。
V型、Ⅶ型的空泡发生的程度较Ⅲ型轻,有时还看不到空泡。而且空泡非常多的V型病例中,可见坏死和再生纤维的共存,而Ⅱ、Ⅲ型中看不到坏死和再生的过程。空泡还可见于慢性周期性麻痹。
6、肌纤维内结构异常即使是HE染色标本,仔细观察仍然可以发现轴空(core)的存在,但肌原纤维网的紊乱却看不清。作为细胞内异常改变,慢性发展的肌营养不良经常出现纤维分割(fibersplitting)、轮状纤维(ringfiber),强直性肌营养不良经常出现肌质块(sarcoplasmicmas)。
(二)改良Gomori染色
改良Gomori染色(modifiedGomoritrichrome)方法在神经肌肉疾病中是必不可少的。肌纤维染成青绿色,结缔组织染成绿色,有髓神经染成红色。比较容易判断肌纤维内末梢神经发生的异常,髓鞘纤维的脱失。
杆状体是最易被本染色方法发现的胞体内异常。而在HE染色下是几乎不能发现的。
本染色法下容易发现的病理变化:多出现于周期性麻痹的管聚集(tubularaggregates),作为非特异性表现经常出现的胞质体(cytoplasmicbody),大量出现这种小体,并伴有先天性肌病临床表现的疾病有胞质体肌病(cytoplasmicbodymyopathy)。成人病例有时能发现大量此小体,伴有近端肌萎缩、呼吸障碍、偶有心肌损害。镶边空泡(rimmedvacuole)是一种类型远端型肌病中的特征性改变,本染色下镶边空泡显示得更清楚明晰。另外,在线粒体肌病时,容易观察到染成红色的异常决增多的线粒体。这种红染的纤维称作破碎红纤维(ragged-redfiber)。
(三)NADH-TR染色
本法除了容易确定肌纤维类型,观察肌纤维类型分布异常之外,最容易观察到肌原纤维网的异常。中央轴空病中见到的轴空“core”是因为该部位的线粒体和肌浆网减少,中心部位如同空芯,像去核水果状,所以称为“轴空”。与轴空改变同样,肌纤维中央部淡染的还有靶样改变(targeted)。周围高活性部分包围中央部低活性部位,如同面包圈状的是靶纤维((targetfiber)。轴空和靶结构类似,靶和靶样纤维也没有本质上的差异,有学者认为,因为这三者的特性几乎相同,应该称为轴空/靶纤维,没有必要区分轴空和靶样改变。但在中央轴空病中出现的轴空贯穿肌纤维的全长,而靶和靶样结构仅仅是几个或几百个肌小节内的扩展。另外靶和靶样纤维的中心部经常可以发现均质无定形物结构一球形小体(spheroid)。从以上理由可以看出,靶和靶样纤维的病理发生机制相同,但中央轴空病的轴空却是不同的,所以分开描述为好。
靶和靶样纤维更多见于神经源性肌萎缩,偶尔也在肌源性疾病中能见到。另外在慢性进展的肌营养不良、神经源性肌病和内分泌性肌病中,虽然见不到典型改变的圆形轴空结构,但可见不规则形状的低活性部分,如同虫噬状,称为“虫噬样改变”(moth-eatenappearance)。在
电子显微镜观察下,可以看到局灶性肌原纤维排列紊乱、Z线水纹化(Z-streaming)等。
NADH-TR中表现为高活性反应的主要有线粒体聚集的破碎红纤维(ragged-redfiber)及管聚集(ubularaggregates)等。
(四)琥珀酸脱氢酶染色
NADH-TR不仅染出线粒体,还能染出其他微粒体,所以当需要特异性染出线粒体时,琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase)色更合适。不管是SDH还是NADH-TR,通常的染色性相似，SDH能更清晰地染出破碎红纤维(ragged-redfiber),而SDH不能染出镶边空泡的周边和管聚集。
(五)ATPase染色
ATPase染色是区分肌纤维类型的最佳方法,对其病理过程反映也最好。高质量活检的肱头肌和股四头肌中,1、2A、2B类型纤维大约各占1/3,呈马赛克状分布。如果看不到这种分布,出现任何一种类型纤维超过55%、缺乏某种特定类型肌纤维、某种特定类型肌纤维变细小、存在大量未分化2C型纤维时,均属于异常。
1、肌纤维类型的分布异常肌纤维类型的分布异常可见于多种疾病。1型纤维、2型纤维各自成群存在时(50个以上聚集为1个群),称为肌纤维类型群组化(fibertypegrouping),是失神经肌肉接受神经再支配的证据,是神经源性肌肉病变诊断的重要根据。当样本太小或者群组化倾向严重时,有时活检肌肉只存在某种特定类型的肌纤维。发展非常缓慢,或神经再支配非常完善的肌肉往往看不到群组萎缩,在HE中很难发现异常。即使在这种情况下,经常需要进行ATPase染色,发现肌纤维群组化后才能诊断为神经源性改变。
除了诊断明确的神经源性肌病以外,其他疾病只要1型纤维超过5%,就可称为1型纤维优势(type1fiberpredominance),这种病理改变的出现只局限于特定的几种疾病。最常见的是先天性肌病(中央轴空病、杆状体肌病、肌管性肌病先天性肌纤维类型不均衡)。
具有先天性肌病的临床症状,肌纤维内没有特异性结构变化时,多半是1型纤维优势的先天性肌病(congenitalmyopathywith1fiberpredominance),有时甚至可以见到2型纤维完全消失的病例,称为均一化1型纤维的先天性肌病(congenitalfiber)。
这些病理改变的意义将在先天性肌病章节中论述。1型纤维优势多见于强直性肌营养不良、肌营养不良后期、线粒体肌病等代谢性肌病的进期。2型维优势多见于神经源性肌病。
2、肌纤维类型的萎缩特定类型的肌纤维变细小时也属于异常。1型纤维选择性变细小时(与2型纤维相差12％)，局限于特定的疾病,代表性疾病为先天性肌病,几乎所有的病例都能看到。又称为1型纤维发育不全hypoplastictypeIfiber)。
具有先天性肌病的临床症状,肌纤维内没有特异性结构改变,只有1型纤维变细为主要特征称为先天性肌纤维类型不均衡(congenitalfibertypedisproportion)1型纤维变细(1型纤维萎缩)多见于强直性肌营养不良(先天性、成人型)、不动性萎缩、强直性脊柱综合征((rigidspinesyndrome),失重力状态等。与之相反,2型纤维,特别是2B纤维选择性变细(2型纤维萎缩),多见于中枢神经性肌麻痹(脑瘫、脑卒中后、变性病)、类固醇肌病、失用性萎缩营养不良、老年人、胶原病等多种疾病,大部分是非特异性表现。
3、2C型纤维的意义2C型纤维具有1型和2型纤维中间的特性,常规ATPase染色和酸性前处理(pH4.6,pH4.,2)都表现为浓染。在婴幼儿的正常肌肉中可以看到,但4-5岁之后几乎消失。婴幼儿根据肌肉的不同、而且同一个肌肉中不同的肌束,2C纤维的出现频率也各有不同。正常要幼儿的肱二头肌和股四头肌中2C纤维一般不超过5%。
2C纤维大量出现,主要是以下3种情况。
首先,未成熟肌纤维的残存。出生早期、肌管细胞时期全部是2C型纤维,根据支配的神经的不同而分化为不同类型的肌纤维。韦德尼希一霍夫曼(Werdnig-Hoffmann)病时,肌肉分化前或分化过程中因脱神经而停止分化,可以看到大量2C型纤维。另外,先天性肌病、先天性强直性肌营养不良也可以见到2C型纤维,这也是肌肉的发育分化延迟,即反映肌纤维的未成熟。
第二,再生肌。肌营养不良和多发性肌炎的肌纤维发生坏死后,继而再生,这种再生肌在相当长的时间内显示为未分化的2C型纤维染色性。
第三,神经源性疾病中,失神经支配的肌肉发生神经再支配,肌纤维类型改变。比如,1型纤维的神经支配被阻断,继而被2型纤维的神经再支配时,肌纤维类型从1型→2C→2型变换。相反,2型纤维失神经后被1型纤维神经再支配后,纤维类型从2型→2C→1型变换。在神经源性疾病中神经再支配旺盛的肌肉,在肌纤维群组化的同时,可见大量的2C型纤维。
另外,看到2C纤维时,有时支持代谢性肌病的诊断(线粒体肌病中少量出现)。
如上所述,1型纤维呈优势,2型纤维缺乏的情况并不少见。最多见到的是2B纤维缺乏,在进行性肌营养不良、先天性肌病、代谢性肌病中高频率出现。
(六)酸性磷酸酶染色
在本染色中显示高活性的是:①坏死纤维中的巨噬细胞;②自噬反应细胞(糖原病Ⅱ型,镶边空泡);③再生纤维;④蜡样脂褐素沉积症的蓄积物。糖原病Ⅱ型的成人型,有时糖原的蓄积不太明显,缺乏特异性肌病理表现。但酸性磷酸酶染色能发现大量高活性纤维,对诊断有很大帮助。
(七)碱性磷酸酶染色
在本染色中呈现阳性的是再生纤维和小血管。再生纤维只限于再生初期的纤维。
(八)非特异性酯酶染色
本染色中显示高度活性的部分是神经肌肉接头处,用于确定神经终板的存在。另外,失神经的小角化纤维(smallangularfiber)也浓染,从而可以避免忽略小角化纤维。但因为再生纤维也被浓染,当鉴别小角化纤维是再生肌还是失神经的小角化纤维时,需要其他染色方法的帮助。
(九)乙酰胆碱酯酶染色AchE)
本染色可特异性染出神经肌肉接头处。神经肌肉接头处异常(重症肌无力,失神经的肌肉)时,活性减低,成为颗粒状。
但本法只是观察酶活性,不一定反映出形态学异常,所以诊断学意义上的重要性较低。
(十)PAS染色
本染色对于细胞内糖原贮积的糖原病(I、ⅢV、Ⅶ型)和多糖体贮积性疾病的诊断必不可少。
冷冻切片中糖原颗粒容易流出,形成空泡。电子显微镜检查时用戊二醛、锇酸固定处理,树脂包埋,切成1um后,用本染色法,能得到更好的结果。
(十一)油红O染色
本染色对细胞内脂肪贮积的脂质代谢异常性肌病(lipidstoragemyopathy)的诊断是必不可少的。
小脂肪滴在正常肌肉内也存在,多见于1型纤维,但肉*碱缺乏症或线粒体电子传导系发生异常时脂肪滴增加,可见脂肪滴的大小不同。
(十二)细胞色素C氧化酶染色(ytochromeCoxidase)
本染色法对于检查线粒体电子传导酶的异常是必不可少的。正常肌肉中1型纤维浓染,2型纤维淡染。因为线粒体存在的部位染成颗粒状,染色性与NADH-TR相似。缺乏酶的肌肉整体的染色性低下,但也有时表现为活性正常,或干脆有浓染纤维散在分布。
有时完全没有活性的纤维散在分布,称为部分缺乏,高频率出现于慢性进行性眼外肌麻痹。(chronicprogressiveexternalophthalmople-ia,CPEO,被称为CPEO的特异性空泡内蓄满糖原,被
病例)。表现。在分乏本身在CPEO之外的线粒体病中也可,还可见于强直性肌营养不良和慢性进展的肌营养不良。
慢性进行性眼外肌麻痹的全部进展病例,均表现出活性低下,肌肉活检分离的线粒体内细胞色素C氧化酶活性也低下。
(十三)其他
磷酸酶染色对于MCArdle病(糖原贮积症V型),磷酸果糖激酶染色对于垂井病(糖原贮积症Ⅶ型),腺苷酸脱氨酶染色对于该酶缺乏症的诊断是有很大帮助的。
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