GPRC5B是G蛋白偶联受体(GPCRs)家族中内源性配体尚不清楚的“孤儿受体”，已有研究表明其是血管平滑肌细胞（SMC）收缩和分化的重要调节因子，在主动脉平滑肌中富集，表现出自发分化的迹象，但具体功能尚不清楚。
德国马尔堡大学研究了GPRC5B调节人和小鼠SMC收缩和分化的作用，以及在他莫昔酚诱导、SMC特异性敲除小鼠(iSM-Gprc5b-KO)的动脉高血压和动脉粥样硬化条件下的作用。
研究的首要任务是明确GPRC5B是否具有血管张力调节作用。使用平滑肌细胞特异性GPRC5B敲除小鼠、他莫西芬（一种抗雌激素）诱导和Myh11-Cre/ERT2小鼠构建GPRC5B极低表达或不表达的iSM-Gprc5b-KO小鼠模型。Westernblotting检测GPRC5B蛋白表达与流式分选出骨骼肌血管中的平滑肌细胞进行mRNA测序来验证iSM-Gprc5b-KO小鼠模型是否成功。
随后，作用于TP受体的α1肾上腺素受体激动剂phenylephrine和血栓素A2类似物U刺激正常对照组、iSM-Gprc5b-KO模型组小鼠，检测肌原性张力，结果显示两组小鼠的收缩反应正常。两种作用于环前列腺素受体（IP）的环前列素类似物cicaprost和iloprost对血管舒张的反应显著增强，而由肾上腺素激动剂isoproterenol或NO供体硝普钠(SNP)诱导的血管张力没有改变，acetylcholine诱导的内皮依赖性舒张也没有改变。综上所述，这些数据表明，在GPRC5B缺乏的SMC中对IP介导的张力选择性增强。
iSM-Gprc5b-KO的血管反应性
第一部分的研究结果显示了GPRC5B缺乏的SMC中对IP介导的张力选择性增强，接下来通过检测GPRC5B缺乏的SMC中IP信号通路的变化进一步确证。
IP受体介导的SMC张力依赖于Gαs介导的腺苷基环化酶异构体激活和cAMP/PKA依赖的细胞内钙水平、细胞超极化降低，以及RhoA/ROCK介导的肌球蛋白磷酸酶抑制，这些变化共同导致MLC20磷酸化水平降低，进而导致肌动球蛋白收缩性的降低。为了测试IP受体介导的cAMP生成是否在GPRC5B缺失的SMC中发生改变，采用siRNA构建人主动脉SMC(hAoSMC)的GPRC5B沉默模型。Basal和isoprenaline诱导的cAMP在对照组和沉默组中没有差异，而iloprost诱导的cAMP在沉默组增加。接下来，探究IP受体介导的cAMP生成是否足以减少MLC20磷酸化。U刺激hAoSMC可导致对照组和GPRC5B沉默组细胞MLC20磷酸化水平都升高，而这种效应在iloprost使用后显著逆转。相比之下，在对照细胞中，iloprost仅轻微降低U诱导的MLC20磷酸化水平。这些数据表明，GPRC5B缺失会导致小鼠和人SMC中IP受体信号的选择性增强，这种信号增强不是因为hAoSMC或小鼠SMC中IP受体在mRNA或蛋白水平上的表达增加。
GPRC5B沉默(siGPRC5B)后，IP受体介导的信号通路增强
考虑到GPRC5B缺乏的SMC中IP受体的总水平没有改变，接下来研究了GPRC5B是否调节细胞内IP受体转运。将编码HA-taggedIP受体(HA-IP)的质粒转染到HEK细胞中，ELISA检测GPRC5B敲低或过表达后未通透细胞中HA-IP的膜表达情况。
结果发现敲除GPRC5B后增强了HA-IP膜丰度，而过表达GPRC5B则降低了HA-IP膜丰度，其他随机选择的GPCRs如HCA2、P2Y10过表达不影响IP的膜表面表达。免疫荧光染色显示：在GPRC5B不过表达的情况下，IP信号主要出现在细胞膜内或细胞膜附近。通过小麦胚芽凝集素(WGA)鉴定可知：在过表达GPRC5B的细胞中，HA-IP信号被转移到细胞内区域。这种胞内运输的改变不影响HEK细胞中总IP蛋白水平，而iloprost诱导的胞内靶向运输HA-IP的动力学没有改变。有趣的是，在iloprost刺激后GPRC5B似乎与IP共表达。
为进一步确定胞内GRPC5B和IP的定位，使用高尔基体标记物GM、内质网标记物calnexin和核内体标记物EEA1进行共染色，结果显示：GPRC5B-Myc和HA-IP与高尔基体和内质网部分共定位，而与核内体的共定位不那么明显。为研究GPRC5B的过表达如何改变细胞内IP的转移，测定了HA-IP单转染和HA-IP/GPRC5B-Myc双转染细胞中不同细胞器标记的共定位Manders系数。结果发现GPRC5B的过表达显著增加了IP与高尔基体标记物GM和内质网标记物calnexin的共定位，而与核内体标记物EEA1的共定位没有显著增加，提示GPRC5B的存在影响高尔基体和内质网中IP受体的表达。
HEK细胞中GPRC5B与IP的共定位
为测试是否在GPRC5B缺失的SMC中也能观察到IP受体的膜定位增强，使用一种针对IP受体细胞外环3(IP(ec))的抗体来测定未通透的hAoSMC中膜表面IP的表达。与HEK细胞中的研究结果一致，GPRC5B缺失的hAoSMC与对照细胞相比膜染色增强。紧接着研究了在iSM-Gprc5b-KO小鼠的血管中是否也观察到类似的变化，通过骨骼肌小动脉的免疫组化分析，检测cre受体介导的EGFP表达显示：IP(ec)免疫反应性显著增强。
SMC中GPRC5B与IP的共定位
接下来，探究GPRC5B是否通过物理交互作用调节IP受体转运。首先观察到GPRC5B-Myc和HA-IP信号定位于同一区域，且具有较高的Manders系数，作为共定位的初步证据。免疫共沉淀结果表明：HA-IP和GPRC5B-Myc共表达。更系统地分析IP与GPRC5B之间的相互作用，发现HA-IP下调不仅导致GPRC5B、也导致GPRC5C(GPRC5亚家族的第二平滑肌表达成员)共免疫沉淀。相比之下，另一种与GPRC5B同源性较低的C类孤儿受体GPR未与IP共沉淀。还研究了GPRC5B和GPRC5C是否与平滑肌细胞中表达的其他前列腺素受体相互作用，例如PGE2受体亚型EP，结果未观察到GPRC5C的共免疫沉淀。这些数据表明，在HEK过表达系统中，GPRC5B与IP受体发生物理作用，并与其他类前列素受体如EP2受体不发生作用。为进一步证实这些相互作用数据，使用双色FRAP22来测试IP受体的固定是否仅影响GPRC5B的侧移性。正如预期，在抗体介导的固定化后，mTurq2-IP或CFP-24ar的恢复明显降低。然而，固定mTurq2-IP后GPRC5B-mCitrine的恢复明显降低，而固定CFP-β2AR对GPRC5B-mCitrine的侧迁移率影响很小。结合免疫共沉淀数据，这些数据支持了GPRC5B和IP受体之间的具体物理相互作用。
GPRC5B与IP的物理相互作用
接下来，研究iSM-Gprc5b-Kos中增加IP是否足以改变体内血管张力。为验证这一点，将对照组小鼠和尚未诱导的KO小鼠植入遥测导管，并监测3天的基础血压，他莫西芬连续诱导5天并监测血压变化。与对照组相比，iSM-Gprc5b-KOs表现了轻度的低血压，并很快得到了补偿。为了研究SMC中GPRC5B的缺失是否能改善高血压病，采用两种模型：1）植入AngII释放的小渗透泵；2)皮下植入释放鼠醛固酮类似物醋酸去氧皮质酮(DOCA)的颗粒，通过单侧肾脏切除术和饮用水增加盐负荷。值得注意的是，敲除发生在高血压病建立后诱导的这些模型中，这使得能够研究GPRC5B失活在治疗环境中的作用。为此，首先监测两组实验小鼠前5天动脉高血压的变化，然后用他莫西芬诱导。在这两种模型中，iSM-Gprc5b-KOs与对照组相比，都能显著降低血压，这表明在SMC中GPRC5B的缺失确实有助于高血压疾病的缓解。虽然3周的高血压是一个很短的观察周期，但研究发现了末期器官损害减少的初步证据：高血压引起的心肌肥厚(用心脏重量/体重比来衡量)在iSM-Gprc5b-KOs中呈下降趋势，体重无显著差异。
为研究IP信号增强在多大程度上促进了这些变化，测试了IP拮抗剂Cay在诱导血管依赖性高血压16天后对对照组和iSM-Gprc5b-KOs的影响。结果发现腹腔注射10mg/kgCay后，显著提高了iSM-Gprc5b-KOs的血压，但对对照组小鼠没有影响。这些数据表明，增强的IP信号确实是iSM-Gprc5b-KOs中观察到的改善高血压病的主要因素。
使用iSM-Grpc5b-KOs进行动脉血压测量
IP受体不仅介导血管张力，而且诱导SMC从合成的、增殖的表型向静息的、收缩的表型分化，作者研究了hAoSMC中分化和收缩性标记基因的表达，发现GPRC5B缺失的hAoSMC中收缩基因的表达增强，如ACTA2和TAGLN，且MKI67、PCNA、CCNA2等增殖标志的基因表达降低。为测试这是否归因于IP受体信号通路的增加，随后分析了在IP受体拮抗剂Cay存在下GPRC5B缺失的SMC中相关基因表达，检测结果显示IP受体的抑制在很大程度上使收缩标记物ACTA2和TAGLN的表达正常化，提示IP信号增强是GPRC5B缺失的hAoSMC分化增加的基础，且IP拮抗剂可以逆转GPRC5B缺失的hAoSMC增殖减少的现象。
那么体内是否也能观察到SMC的分化增加？为此对FACS标记的对照组小鼠和具有SMC特异性EGFP表达的Gprc5b-KOs小鼠血管SMC进行mRNA测序，结果显示GPRC5B缺失的mSkSMC中SMC分化的标志基因，如Acta2、Tagln、Actn1、Flna,Des、Tpm1/2、Dstn等表达增加，此外，炎症激活基因如Icam1、Ptgs1/2、Nfkb1或蛋白多糖如lumican(Lum)或decorin(Dcn)的表达减少。新鲜分离的鼠主动脉SMC(mAoSMC)中GPRC5B阳性的SMC降低了Myh11和Acta2的表达，进一步支持了GPRC5B表达与SMC分化相关的假设。总之，这些数据表明，在人类和小鼠的SMC中，GPRC5B是SMC分化的调节器。
GPRC5B缺失增强血管SMC分化、减少增殖
鉴于GPRC5B在调节SMC的分化中发挥作用，最后研究了在iSM-Gprc5b-KOs中动脉粥样硬化的发展。在Apoe-/-小鼠的衰老过程中以及动脉粥样硬化发展的反应中，mAoSMC中GPRC5B表达增加。为研究改变的分化和增殖如何影响动脉粥样硬化的发展，Apoe-/-小鼠高脂饮食16周后对主动脉斑块进行检测，结果发现iSM-Gprc5b-KOs中油红O染色的斑块面积在全主动脉呈减少趋势，主动脉弓明显减少，而平滑肌分化标记物-SMA的免疫反应性增加。与此同时，动脉粥样硬化早期小鼠主动脉中分离的mAoSMC的mRNA测序显示，GPRC5B缺陷SMC表达的收缩标志物Acta2、Tagln或Smtn水平较高。
Gprc5b-KO小鼠缓解动脉粥样硬化
从机制上讲，本研究发现GPRC5B的敲除在体内和体外都增加了IP的膜定位，而且GPRC5B与IP发生物理作用，证明了在GPRC5B缺失的平滑肌细胞中增强的IP信号通路不仅促进血管张力，而且在动脉粥样硬化的发展过程中起到缓解作用。综上所述，所有数据显示GPRC5B通过负向调节IP信号传导来调节血管SMC张力和分化。
临床前景：
1.GPRC5B调节人和小鼠血管平滑肌细胞中IP的可利用性。
2.在平滑肌特异性Gprc5b敲除小鼠中，IP信号的增加导致血管舒张的促进和平滑肌分化的预防。
3.平滑肌特异性Gprc5b-KOs对动脉高血压和动脉粥样硬化的保护作用。
临床意义：
抑制GPRC5B与IP的相互作用可能对人动脉高血压和血管重构有益。
参考文献：
CarvalhoJ,ChennupatiR,LiR,GüntherS,KaurH,ZhaoW,TonackS,KurzM,M??leinN,BünemannM,OffermannsS,WettschureckN.OrphanGProtein-CoupledReceptorGPRC5BControlsSmoothMuscleContractilityandDifferentiationbyInhibitingProstacyclinReceptorSignaling.Circulation.Apr7;(14):-.
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