DNA构象变化在调控基因表达和介导药物-DNA相互作用中起着重要作用。然而，由于这一过程具有高度动态性，直接探测瞬时DNA构象变化仍然具有挑战性。在中国科学院上海硅酸盐研究所的李江教授及上海交通大学化学化工学院沈建磊助理教授的研究论文ProbingtransientDNAconformationchangeswithanintercalativefluorescentexcimer中，他们提出了一种无标记的荧光方法，使用DNA嵌入剂K21监测不同长度和形状的DNA瞬时的构象变化，该研究成果发表在AngewandteChemieInternationalEdition上。
DNA构象变化是发育和疾病过程中基因调控的重要机制。例如，一些非B型DNA结构中的微小畸变，包括基因组中的G-四链体、i-motifs和Z-DNA结构，将导致这些DNA结构的紊乱，以及无数的遗传疾病，如弗里德赖希共济失调(FRDA)、脆性X综合征(FRAX)、亨廷顿病(HD)、强直性肌营养不良症(DM)等。用于表征DNA构象变化的传统方法包括单晶X射线衍射、冷冻电镜(cryo-TEM)和原子力显微镜(AFM)等。然而，这些技术需要大量的样品处理，并且只捕获DNA的静态构象，使得实时探测瞬时的构象变化在技术上具有挑战性。
到目前为止，各种检测DNA结构和拓扑变化的技术和策略已经发展起来。其中，F?rster共振能量转移(F?rsterresonanceenergytransfer,FRET)是一种常用的构象动力学探测技术。例如，单分子FRET可以探测DNA局部自发变性后“DNA气泡”的形成。FRET技术的局限性在于需要对疏水性荧光团进行位点特异性修饰，这可能会干扰DNA的稳定性。因此，目前急需发展一种无标记荧光技术来检测DNA构象变化。一般来说，有机染料通过三种基本机制与DNA结合:嵌入、沟槽结合和半嵌入，这些结合方式是通过疏水和静电相互作用来实现的。最近有报道称，苯并噻唑系列菁染料K21通过与小沟槽结合，在双链DNA模板上形成J-聚集体，这种染料的排列促进了沿DNA线的远程激发能量传递过程。由于染料在DNA模板上的相互作用较弱，可以认为DNA构象的瞬时变化可能会导致染料的排列方式发生重排，其发射行为也可能发生重排。在这篇文章中，作者报道了K21在DNA模板上的排列随着DNA瞬时构象的改变而改变。在一定的实验条件下，作者发现DNA模板上形成了一个新的聚集态—准分子，而不是J-聚集体。作者将K21的不同聚集态归因于缓冲溶液的离子强度不同，从图1可看出，在稀释的溶液中，K21在nm处的荧光发射强度较弱，然而，在分子内运动受到限制的情况下，与DNA双链结合后，荧光发射强度显著增强。图1同时，二聚体和高级结构分子聚集体可以通过静电相互作用与沟槽结合，沟槽的限制空间有利于K21形成准分子。这一过程中，瞬时的DNA构象决定了单体和准分子的染料数。因此，不同的DNA瞬时构象可以通过单体与准分子之间的比率发射(ratiometricemission)来反映。单晶X射线分析和K21在高浓度溶液中的发射证明了准分子的形成。通过这种方法，作者成功区分了具有不同瞬时构象稳定性的DNA结构，包括错配的dsDNA，G-四链体，i-motifs以及不同拓扑状态下的质粒DNA。进一步，作者在共聚焦荧光显微镜下研究了质粒DNA经限制性内切酶(EcoRI)酶切前后的构象动力学。因此，这种无标记的方法在监测DNA的瞬时构象变化方面具有巨大的潜力。除此之外，作者还研究了K21的光物理性质，其在DMSO中的吸收峰在nm处，最大发射峰在nm处。由于分子内双键的运动导致激发态的能量被消耗，只观察到微弱的荧光。此外，为了研究K21的聚集态行为，作者还测定了K21在不同比率的水/DMSO组分中的吸收光谱和光致发光(PL)光谱，其中水是K21的不良溶剂。从图2c可看出，在不同水的比率下的吸收变化可以忽略不计，说明在这些条件下没有形成H型或J型聚集体。图d表明，随着含水率的增加，K21在nm处的发射稍有增强，这是因为聚集体的形成限制了分子的运动；同时，在nm处的长波长发射明显增强，这与准分子的形成有关。图2基于之前的研究，作者提出dsDNA可以为K21提供一个纳米级限制环境，K21根据DNA瞬时构象的变化而改变自身在dsDNA上的排列。如图3a所示，由于dsDNA长度较短(7bp)，双链不稳定，K21与ssDNA的亲和力较弱。当dsDNA长度在8~12bp左右时，dsDNA处于亚稳状态，这不仅富集了DNA表面的K21浓度，而且为分子间的相互作用提供了足够的弛缓空间。当长度超过12bp时，dsDNA双链结构稳定，K21分子被固定在DNA上，分子间相互作用受到限制，形成准分子。为了进一步验证该推测，作者研究了不同Mg2+浓度下的K21-dsDNA(10bp)复合物的PL光谱，如图4f，4g所示，随着Mg2+浓度的增加，准分子的发射强度逐渐降低，单体发射强度逐渐增加。这一结果表明，Mg2+可以稳定DNA的双链结构，限制了K21在DNA上的自由旋转，从而增加了单体的发射，减少了分子间的相互作用，降低了准分子的发射。图3图4作者还将该方法用于区分dsDNA中的单碱基错配和多碱基错配，图5表明突变数的增加会大大降低DNA双链的稳定性，准分子的发射量也随之增加。图5总之，作者开发了一种无标记方法来探测不同DNA结构的构象动力学。该体系的工作机制可以总结为:DNA双螺旋结构提供纳米级的限制空间来富集K21，其中K21表现出两种形式，一种是单体，另一种是短寿命的二聚体分子(准分子)，它们拥有不同的荧光发射光谱。DNA双螺旋的瞬时构象变化可能导致K21在单体形态和准分子形态之间的转变，最终导致荧光发射比的改变。与传统的单色嵌入染料(如EtBr、SYBRGreen和YOYO-1)相比，这种结构敏感的双色染料可以为检测目标核酸结构提供更高的分辨率。因此该染料在核酸分析的应用方面具有很大的潜力，如单分子分析、显微成像和护理诊断等。