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摘要：细胞的构成具有高度组织性，依赖于复杂的定位机制准确地将各种胞内分子转运至亚细胞部位。这些转运过程对于细胞的正常运转及机体发挥特定功能是至关重要的，基因紊乱将影响这些转运系统导致疾病的发生。RNA分子的转运是调控细胞构成中的重要层面，是广泛存在且进化上高度保守的。RNA定位常由反式调控因子如细胞核内的RNA结合蛋白介导，这些因子能够识别RNA中的特定的顺式作用元件。本文中，我们首先从编码和非编码RNA角度阐述了细胞内RNA转运的功能和生物学益处。然后我们探讨了介导定位的分子机制，重点陈述了顺式和反式作用的多种功能及新发明的能够有效探索RNA定位途径的技术及资源。之后我们讨论了最近的发现，其揭示了细胞核内的共转录调节可影响RNA分子在胞浆中的定位。最后，我们发现许多与RNA转运通路异常有关的疾病如脊髓性肌肉萎缩症、阿尔兹海默症、脆性X综合征和强直性肌营养不良。这些强调了需要进一步阐明RNA定位的机制，最终实现基于RNA的诊断及治疗策略。
重点：RNA定位是普遍的且在基因调控中具有重要作用，调控RNA定位的顺式和反式作用的复杂网络核内过程对于mRNA的胞浆定位是重要的，一些神经肌肉疾病与RNA定位异常有关。
关键词：mRNA定位、特定空间翻译、RNA结合蛋白、顺式作用元件、核内过程、RNA病理学
1.前言：
在真核生物中基因表达的调控是由多种调控方式调控的，在RNA的生命周期中不同时间点均有调控。从转录起始至随后的成熟，最终影响到其加工，稳定性及定位，将mRNA所带信息翻译成蛋白质（图1）。这些调控是高度复杂的，常发生在细胞的不同部位：从RNA初次合成为新生不成熟的前体的细胞核亚区至成熟部位再至细胞浆甚至超出细胞被分泌到细胞外。因此，RNA分子的亚细胞分布不仅对于RNA的成熟的协调是重要的，而且对于基因组转录出的多种编码及非编码RNA在细胞功能的调节中也是至关重要的。RNA定位被认为是高度调控性过程，是被特定的顺式作用元件及反式作用的与RNA结合形成核糖核蛋白复合物（RNP）的RNA结合蛋白调控，最终决定了RNA在细胞内的“命运”。
图1
本综述中，我们首先讨论了RNA定位的生物学和细胞功能，随后阐述了RNA定位在分子水平的一般原则，包括顺式及反式作用因子，强调了用于RNA定位通路的关键的新出现的技术和资源。除此之外，我们还涉及了许多其他与定位有关的在细胞核与细胞浆之间的转录后水平调控的内容。因此，我们将进一步详细阐述共转录定位调控因素如基因启动子区及随后的加工如剪接及包括翻译抑制及分区翻译的协调在内的发生在胞浆内的过程。最后我们探讨了许多与RNA转运异常有关的疾病，再次突出了亟需阐明RNA定位的通路机制以帮助人类战胜疾病并制出针对性的治疗措施。
2.RNA定位的功能和机制
细胞运转的协调性依赖于其能够将各组分包括DNA、RNA及蛋白分子转运至准确的亚细胞、细胞器及亚细胞器位置。实际上，mRNA的转运及其编码的蛋白之间的关系错综复杂。各种分子在其序列内都具有转位信号[1，2]以调控其转运至细胞特定部位，且相互影响[3]。经典的细胞内蛋白转运的调控机制集中于最初被描述的发生在有膜的细胞器如内质网、线粒体或叶绿体等的共翻译或翻译后水平调控[4,5]。例如，分泌性或穿膜的位于内质网的蛋白一般被认为是在共翻译水平来源于核糖体的新生蛋白的信号肽，与信号识别小体结合，进一步引导mRNA-核糖体-新生蛋白复合体至内质网[1,6-8]。这代表了一种经典的能够引导特定的mRNA至特定细胞器的由多肽构成的定位信号机制。
相反，mRNA的序列内也包含调控其亚细胞分布的顺式定位调控元件，其定位调控伴随翻译过程的定位，促进了编码蛋白至特定部位的转运[2,9,10]。虽然传统上认为RNA定位是个别转录物的少见现象，但是全转录组研究发现实际上它是非常普遍的并且对于细胞运转的作用比之前想象的广泛[11-20]。此外，一些最近的研究使用高通量的方法探索了在接近线粒体及内质网的胞浆部位的mRNA翻译，表明功能上一致的mRNA通过一种RNA定位信号的机制在这些细胞器上翻译发生位置相近[21-28]。实际上，RNA分子的亚细胞定位是一种古老的行为，在多种生物体如细菌、酵母、真菌、植物、昆虫及哺乳动物中均有述及[29-34]。一些mRNA及非编码RNA在人类细胞及果蝇胚胎中定位的例子见图2.
图2
2.1RNA定位的生物学及细胞功能
RNA分子包括编码及非编码RNA的亚细胞定位具有多种作用。一个主要的功能为保证基因表达的协调性及效率。实际上，由于基因表达的许多步骤都需要特定的非编码RNA的参与且发生在细胞的不同部位，因此调控性RNA及其调控靶标的定位对于补充相互作用元件及保证相关活动的有效执行是至关重要的。例如，小核仁RNA（snoRNA）、小核RNA（snRNA）及多种长链非编码RNA（lncRNA）在细胞浆、细胞核亚区及与其功能一致的区域具有不同的定位特点[35]。
MRNA定位的调控有助于细胞发挥功能，尤其是有益于其翻译产物。第一，与每次需要时从细胞远处合成和转运蛋白分子截然不同的是，mRNA作为多次翻译的模板在细胞内转位有益于降低蛋白在原位合成后对于外界刺激反应的快速转运的成本[2,9]。例如，在神经元中蛋白的快速定位调节对于树突可塑性是必须的[36,37]。类似地，轴突中的定位翻译对于引导生长圆锥在有细胞外刺激时的定向迁移是必要的，这对于发生损伤时轴突的再生尤其重要[37,38]。此外，比起既已存在的分子，由转位的RNA新合成的蛋白可根据其在细胞内作用的不同进行不同的翻译后修饰。第二，mRNA的局部定位可防止蛋白进入错误的亚细胞区域，避免这样对细胞运转及存活产生有害效应。一个经典的例子是，编码髓鞘碱性蛋白的mRNA定位限制在少突胶质细胞的髓鞘内以保证在必要的区域合成蛋白，避免在细胞内不必要的膜聚合[39,40]。还有一个很好印证此理论的例子是，果蝇的胚胎发育决定因素如bicoid和oskarmRNA的异常定位可以造成胚胎发育障碍并扰乱正常的胚胎发育[41-43]。第三，一些编码蛋白复合体不同祖分的mRNA具有类似的定位模式，因此它们可以同时转运且定位翻译以保证高效地组装成蛋白复合体[16,17,44,45]。例如，编码Arp2/3actin多聚成核复合体的7个蛋白成分的mRNA均位于成纤维细胞的突出中，证实了mRNA的定位可促进此复合体的共翻译[46，47]。前述讨论的在线粒体及内质网的mRNA共定位的例子中[11-15]，定位翻译对于细胞骨架相关蛋白的定位是非常重要的[16,17,44,48]。实际上，亚细胞定位对于蛋白组的构建及适应是一个重要影响因素[49]，因为数学模型研究预测在细胞内同一部位合成各组分可明显提高蛋白复合物的组装效率[50]。最后，我们通常将一个mRNA的功能与其编码的蛋白联系在一起，实际上一些mRNA发挥功能并不依靠其编码的蛋白。例如，非洲爪蟾蜍的VegTmRNA以不依赖于翻译的作用促进卵母细胞角蛋白网络的形成[51，52]。通过对果蝇oskar基因的mRNA及蛋白敲除的详细基因学分析发现，oskar的mRNA3’UTR区以不依赖于oskar蛋白的方式在卵子发生的过程中发挥重要作用。其作用机制为oskar3’UTR区含有多个翻译抑制蛋白Bruno的结合位点，二者相结合可抑制Bruno的作用[53,54]。类似地，最近发现小鼠Ube3amRNA的同构体可以不依赖于编码蛋白的形式通过竞争性抑制miRNA-（mIr-）促进大鼠海马神经元的脊髓树突成熟[55]。非常明了的是，除了蛋白定位机制具有重要作用，RNA分子的亚细胞定位对于协调细胞的运转及发挥功能亦具有重要作用。总之，在微观层面的基因调控定位的协调最终将呈现出宏观益处。
2.2广义上的RNA定位细胞机制
目前，关于RNA定位调控的广义机制已被部分阐明[56]。被最普遍认为的是RNA通过mRNPs与运动蛋白的相互作用沿细胞骨架转运，运动蛋白有助于其沿肌动蛋白丝或微管网络定向移动[57]。例如，一些编码模式蛋白（如fushitarazu,hairy,runt）及信号分子（如wingless）的mRNA位于果蝇胚胎上皮细胞的顶端细胞质中[58-60]，这可能会限制果蝇早期胚胎阶段合胞体中模式分子的活动[61]。这些转录物向顶端的移动的发生通过微管末端的定向移动及RBPEgalitarian、theBicaudal-D适配体蛋白和Dynein动力蛋白的作用实现[62-64]。第二种机制叫做扩散-保留模式，一种通用的伴随RNA锚定于细胞内某个特定部位的扩散模式，此机制已在nanos及果蝇卵母细胞中被证实[65]。第三种机制为选择稳定性模式即细胞内所有的RNA均会被降解除非某个特定区域被保护起来，这一模式首先在果蝇胚胎的hsp83mRNA被发现[66,67]。第四种RNA定位的机制为选择性限制机制即转录物被限定在特定的亚细胞部位避免其与细胞内其他祖分接触。例如，最近发现果蝇早期胚胎某些特定的受精卵mRNA的胞核转运在受到基因*性刺激是被阻滞，导致这些mRNA在核质中广泛分布，此机制为进化来的能够消除核缺陷的质控途径[68]。值得注意的是，位于果蝇胚胎中的nanomRNA的定位是通过扩散-保留、选择稳定性及定向转运机制共同完成，这个广泛的机制也可以一致解释某个给定转录物的定位特征。由于关于RNA定位调控的广泛机制已有综述报道[2,9,10,56,57]，此处不再赘述。我们将重点讨论RNA定位的广义的分子机制及帮助探索定位途径的重要的技术发明，同时讲述最近定位调控机制的新发现。
2.3RNA定位调控的分子机制：顺式作用元件
在分子水平，RNA定位通过RNA顺式作用元件调控，与特定转运途径的反式作用因子结合发挥作用[34,69]。顺式作用元件功能上是独立的且可调整的，能够与报告基因RNA分子（如GFP、LacZ）结合反映其调控定位活性。因此，界定这些作用元件的功能区域的常用方式为序列打靶实验，在给定细胞背景中将一段已知区域的RNA与报告基因RNA融合或敲除，然后观察定量定位活性。通过这种方式，基于其一级结构、二/三级结构特征或综合这些特性界定的顺式作用元件在长度上从几nts至超过一千[34,69]。早期一些研究发现顺式作用元件选择性地与mRNA的3’UTR结合[43,70,71]，另一些研究发现可与mRNA的5’UTR或编码区结合，有些可与多个部位结合[69,72-75]。例如，酵母中Ash1mRNA在芽尖中的定位可被与编码区和3’UTR结合的四个茎环结构的顺式作用元件调控，单体形式时刻发挥作用，但结合体形式可增强定位效率[72,76]。这些例子强调了RNA是亚细胞定位可被单个或多个顺式作用元件调控，可一起或多次作用，可与mRNA的各个区域结合，有些或与转录物的编码能力共同进化而来。虽然这些RNA定位的一般原则我们已了解，但是还有一些尚未突破的东西限制着我们对这些重要的调控元件的探索。首要的挑战是了解调控元件的全面特性的实施方式，即他们的序列拓扑学特征及结构特点。尤其需要考虑的是，RNA定位比我们之前想象的更加普遍[45,77]，这表明调控元件可能有多个种类和多样的拓扑学特征。在这方面，近年来发现的许多平行报告系统可确定调控基因表达多个层面（如增强子元件、翻译和RNA稳定性）的DNA和RNA调控元件，这些技术也很容易应用到影响RNA定位的顺式作用元件的研究中[78-84]。第二个主要的限制是我们尚缺乏对于调控RNA定位的反式作用因子的结合特性的了解。然而，如下详述，许多技术发明和资源已被开发，无疑将会探索顺式作用元件/反式作用因子的调控作用开辟新的道路。
2.4RNA定位调控的分子机制：反式作用因子
调控定位的反式作用因子最初认为由RBPs构成，但是实际上还包括非编码RNA，如微小RNA（miRNA）或长链非编码RNA（lncRNA）（图3）。RBPs广义上由涉及RNA代谢的各个方面的进化上高度保守的调控性蛋白构成[85-87]。最近关于对编码RNA结合区域（RBDs）的基因生信研究及用于全面识别通过质谱鉴定出的与多聚腺苷酸RNA相结合的蛋白的相互作用捕获方式表明人类基因组包含超过个不同的RBPs基因。这些因子一般根据其包含的RBDs进行分类，在结构上具有很大的不同[86，91]。多数经典的RBPs含有如RNA识别序列（RPM）、K同源序列（KH）、DEAD-box或锌指区域等介导特异性结合小单链RNA（ssRNA）的区域[91-94]。然而大规模研究表明多种RBPs含有非经典RNA结合区域[89,90,95-97]。此外，一些RBDs特异性识别双链RNA（dsRNAs）的形态或碱基特征[98]，但是另一些RBDs似乎倾向于识别结构区域内的一级结构[91,99]。引人注意的是，RBPs往往为由多个RBDs构成的复合体结构[86,87,]。这使它们能够快速与目标RNA产生多重作用或与多个目标RNA结合[86,87]。例如，β-actinmRNA定位于移层上皮细胞的前缘是通过识别编码结合蛋白1（ZBP1）的2个独立的KH序列的双重定位元件实现的[]。基于RBP结合的倾向性，我们可以猜测RNA定位调控可能涉及到目标RNA特异性序列、结构的综合因素或调控元件的综合因素（图3A）。此外，正如ZBP1一样，编码元件结合区域的拓扑结构对于阐明RNA定位机制具有重要作用。以前的识别编码元件的研究往往